Embora a ozonioterapia seja amplamente aplicada quando são necessários reparação de feridas e efeito antimicrobiano, pouco se sabe sobre os mecanismos celulares relacionados a este processo. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a citotoxicidade do ozônio em linhagens celulares de fibroblastos (L929) e queratinócitos (HaCat), o efeito na migração celular e a sua atividade antimicrobiana. As células foram tratadas com solução salina tamponada com fosfato ozonizada (8, 4, 2, 1, 0,5 e 0,25 μg/mL de ozônio), clorexidina a 0,2% ou solução tamponada e a viabilidade celular foi determinada através de ensaio MTT. O efeito do ozônio sobre a migração celular foi avaliado através de ciclos de cicatrização de feridas e ensaios de migração transwell. As concentrações inibitórias mínimas para Candida albicans e Staphylococcus aureus foram determinadas. O ozônio não mostrou citotoxicidade para as linhagens celulares, enquanto que a clorexidina reduziu acentuadamente a viabilidade celular. Embora não se tenha observado uma diferença significativa entre as células tratadas com ozônio e o controle no ensaio de raspagem, observou-se um aumento considerável na migração de fibroblastos em células tratadas com 8 μg/mL de solução ozonazada. O ozônio isolado não inibiu o crescimento de microrganismos; No entanto, sua associação com clorexidina resultou em atividade antimicrobiana. Este estudo confirma a cicatrização de feridas e o potencial antimicrobiano da terapia de ozônio e apresenta a necessidade de estudos para elucidar os mecanismos moleculares através dos quais ele exerce tais efeitos biológicos.