A terapia com oxigênio-ozônio (O2-O3) é cada vez mais aplicada como um tratamento complementar / adjuvante para várias doenças; no entanto, os mecanismos biológicos responsáveis pela eficácia de baixas concentrações de O3 precisam de investigações adicionais para compreender os possíveis efeitos múltiplos nos diferentes tipos de células. Neste trabalho, focamos nossa atenção nos fibroblastos como células conectivas ubíquas que desempenham papéis na arquitetura do corpo, na homeostase de células residentes em tecidos e em muitos processos fisiológicos e patológicos. Usando uma linha de células de fibroblastos humanos estabelecida como modelo in vitro, adotamos uma abordagem multimodal para explorar um painel de características estruturais e funcionais celulares, combinando microscopia de luz e eletrônica, análise de Western blot, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real e ensaios multiplex para citocinas. A administração de misturas de gases O2-O3 induziu múltiplos efeitos sobre os fibroblastos, dependendo de seu estado de ativação: em fibroblastos não ativados, proliferação estimulada por O3, formação de protrusões da superfície celular, resposta antioxidante e secreção de IL-6 e TGF-β1, enquanto em fibroblastos ativados por LPS, o O3 estimulou apenas a resposta antioxidante e a secreção de citocinas. Portanto, as baixas concentrações de O3 usadas neste estudo induziram respostas do tipo ativação em fibroblastos não ativados, enquanto em fibroblastos já ativados, a capacidade de proteção celular foi potencializada.