O plasma rico em plaquetas (PRP) é uma terapia promissora na medicina regenerativa, mas a falta de padronização nos protocolos de preparação dificulta a obtenção de resultados reprodutíveis. Este estudo teve como objetivo otimizar o protocolo de preparação do PRP investigando o impacto de dois anticoagulantes (citrato de sódio [SC] e ácido etilenodiaminotetraacético [EDTA]) e de dois meios de ressuspensão (plasma versus cloreto de sódio [NaCl]). Foram comparadas as taxas de recuperação plaquetária, a atividade das plaquetas e a liberação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) após a ativação do PRP. A taxa de recuperação plaquetária e a atividade celular foram significativamente maiores no grupo EDTA em comparação ao SC. No entanto, a concentração de VEGF liberada foi maior com o uso de SC. Em relação ao meio de ressuspensão, tanto as taxas de recuperação quanto os níveis de VEGF foram maiores no PRP quando as plaquetas foram ressuspensas em plasma em comparação ao NaCl. O estudo reforça a superioridade do EDTA (como anticoagulante) e do plasma (para ressuspensão) para obter maior recuperação de plaquetas e preservar sua funcionalidade.